Mikrodozymetria

Mikrodozymetria
Mikrodozymetria

Napromienianie żywych komórek hodowlanych

OPISWpływ dużych dawek promieniowania jonizującego na organizm człowieka jest znany, ponieważ skutki znacznego napromienienia organizmu w stosunkowo krótkim czasie pojawiają się dość szybko i są charakterystyczne. Z kolei skutki somatyczne niskich dawek promieniowania mogą wystąpić po długim czasie, rzędu lat. Skutki te określa się mianem stochastycznych, ponieważ o ich występieniu decyduje wiele losowych czynników. Dodatkowo choroby, których przyczyną może być promieniowanie, mogą również wystąpić wskutek działania innych czynników, nie można zatem jednoznacznie stwierdzić, że ich przyczyną była ekspozycja na promieniowanie jonizujące w przeszłości. 
Dlatego skutki niskich dawek promieniowania bada się in vitro, napromieniowując żywe komórki hodowlane i badając ich odpowiedź na napromieniowanie. Jednak aby takie badania można było odnieść do sytuacji in vivo niezbędne jest precyzyjne ustalenie jednakowej dawki promieniowania dla wszystkich naświetlanych komórek. Jest możliwe dzięki skupieniu wiązki promieniowania do rozmiarów porównywalnych z rozmiarami komórek. 
Poniższe fotografie i rysunki, ilustrujące ten eksperyment, pochodzą z pracy doktorskiej pt. Konstrukcja i wykorzystanie mikrowiązki promieniowania X do badań radiobiologicznych na poziomie komórkowym. 

EKSPERYMENT

            
        
Stożkowa wiązka promieniowania z lampy rentgenowskiej wychodząca z obszaru o średnicy ok µm jest ogniskowana na próbce przez układ ogniskujący. Mikroskop optyczny umożliwia podgląd próbki i precyzyjne oznaczenie komórek przeznaczonych do napromieniowania. Dwa silniki krokowe poruszają próbką w płaszczyźnie ogniskowania wiązki. Miedziana przesłona (shutter) zapewnia precyzyjny czas naświatlania. 

Komórki znajdują się na folii Mylarowej w otworze wydrążonym w szalce Petriego.

            
        
Po napromieniowaniu komórki są analizowane. Dla wizualizacji wszystkich komórek stosowany jest barwnik fluorescencyjny DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol), który przenika także przez nienaruszone błony komórkowe wiążąc się z DNA komórek. Wzbudzony światłem UV emituje on światło o barwie niebieskiej. Dla wizualizacji podwójnych uszkodzeń DNA w komórkach, stosowany jest barwnik Alexa Fluor 488, który wzbudzony światłem o długości fali 488 nm świeci na czerwono. Nałożenie tych dwóch obrazów daje wizualizację jąder komórkowych oraz powstałych w nich podwójnych uszkodzeń DNA. 

MODELOWANIEZnając dawkę promieniowania, jaką otrzymała każda z napromieniowanych komórek, można wyznaczyć zależność koncentracji podwójnych uszkodzeń DNA w funkcji dawki. W celu oszacowania dawki opracowane zostały modele komórek oraz wiązki, a także metoda napromieniowywania wszystkich komórek w badanej próbce jednakową dawką.
Model komórkiModel komórki został opracowany na podstawie obrazów komórek w mikroskopie sił atomowych (AFM) w programie WSxM, umożliwiającym uzyskanie przekrojów poprzecznych badanych obiektów.

            
        
Model komórki został przedstawiony  paraboloidą obrotową. Wykres przedstawia modele komórek średniej, największej oraz najmniejszej wykoanane w programie Mathematica.  

Model wiązki

            
        
W układzie mikrowiązki rentgenowskiej w IFJ PAN promieniowanie ogniskowane jest przy pomocy układu wielowarstwowych zwierciadeł, których działanie opiera się na zasadzie Bragga. Odpowiednikiem płaszczyzn krystalograficznych są cienkie warstwy materiału, o grubości porównywalnej z długością fali promieniowania. Grubości warstw zmieniają wzdłuż powierzchni zwiercidła tak, aby w każdym punkcie dla promieniowania wychodzącego ze źródła spełniony był warunek Bragga, kierując odbite promieniowanie do punktu ogniskowania [ Rigaku Optics ].

Układ ogniskujący, przedstawiony na rysunku poniżej,  składa się z dwóch takich powierzchni, ustawionych prostopadle względem siebie, w tzw. geometrii Montela. Zdjęcie obok (lub poniżej jeżeli oglądasz na telefonie ;) przedstawia obraz wiązki zarejestrowany kamerą CCD Photonic Science, rejestrującą promieniowanie rentgenowskie (na kolejnym zdjęciu). Ognisko znajduje się w odległości kilku milimetrów od powierzchni zwierciadeł, dlatego w czasie pomiaru kamera prawie dotyka zwierciadeł.
Promieniowanie może przejść przez układ nie odbijając się od żadnej z powierzchni (duży prostokąt na obrazie wiązki), może też odbić się tylko od jednej z powierzchni (cienkie linie). Właściwą wiązkę stanowi najmniejsza plamka na obrazie, będąca rezultatem odbicia promieniowania od jednej, a następnie od drugiej powierzchni. Po zogniskowaniu pozostałe elementy widoczne na obrazie są przesłaniane. Kolejne ilustracje przedstawią odpowiednio obraz wiązki na ekranie scyntylatora P43 oraz profil wiązki (zdjęcie z mikroskopu optycznego). 

Oprócz rozkładu przestrzennego parametrami charakteryzującymi wiązkę są jej energia oraz intensywność. Do pomiaru tych parametrów wykorzystany został detektor spektrometryczny Amptek. Energia wiązki to 4.5 keV, a jej intensywność przy prądzie anodowym 30 µA wynosi ok. 1.75 · 105 fotonów na sekundę. 

Kształt wiązki przybliżony jest rozkładem normalnym (Gaussa). Mając zatem profil wiązki oraz jej intensywność, która odpowiada całce z tego rozkładu, można stworzyć model wiązki.

PROCEDURAZilustrowane w sekcji modelowanie matematyczne modele komórek ukazują znaczne różnice w ich rozmiarach. Zakładając, że ich gęstość jest przybliżona, różne wielkości oznaczają różne masy komórek. Zatem zdeponowanie w każdej w komórek tej samej energii promieniowania nie oznacza zdeponowania tej samej dawki, która z definicji  jest stosunkiem zdeponowanej energii do masy obiektu. 
Zastosowanym w pracy rozwiązaniem było równomierne napromieniowanie ustalonego obszaru komórek. Jest to możliwe przy odpowiednim doborze wielkości kroku napromieniowanie w stosunku do szerokości wiązki. Otrzymujemy w ten sposób równomierny "deszcz promieniowania". Większe komórki zajmują odpowiednio większą powierzchnię, mają zatem większą masę, ale równocześnie trafia na nie więcej promieniowania dają tym samym równomierny rozkład dawki. Poniższe wykresy przedstawiają odpowiednio rozkłady normalne oraz ich sumę, która dla odpowiednio dobranego kroku kątowego w pewnym zakresie jest funkcją stałą.  

WYNIKIWyznacznikiem odpowiedzi komórek na napromieniowanie był stosunek intensywności barwy czerwonej do niebieskiej na obvrazach wybarwionych komórek. Badania przeprowadzone zostały dla 3 różnych dawek promieniowania przy takim samym czasie inkubacji po napromieniowaniu, oraz dla 4 czasów po napromieniowaniu dla jednej dawki. 

            Pierwsze badanie potwierdza hipotezę liniową na poziomie komórkowym, natomiast drugie ukazuje zdolność komórek do naprawy podwójnych uszkodzeń DNA. Komórki napromieniowanie dawką 32 Gy naprawiły większość uszkodzeń po ok. 10 godzinach.  